必須仔細(xì)考慮所有可能影響實(shí)驗(yàn)的條件和技術(shù)參數(shù)以獲得可重復(fù)且一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，要求實(shí)驗(yàn)人員深入了解和熟練掌握操作過(guò)程才能準(zhǔn)確地構(gòu)建CLP模型。造模評(píng)價(jià)該模型通過(guò)模型動(dòng)物自身引發(fā)膿毒癥，與臨床膿毒癥類(lèi)似的地方在于有連續(xù)分散的細(xì)菌源，血中內(nèi)檢出率及細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率高，動(dòng)物體溫降低以及血流動(dòng)力學(xué)早期高排低阻晚期低排低阻的特征也與臨床相仿，在建模的同時(shí)模擬臨床膿毒癥方法，輔以充分的液體復(fù)蘇和適當(dāng)輔助(如藥物)，另外這個(gè)模型可控性高，標(biāo)準(zhǔn)化水平高。該模型中膿毒癥的嚴(yán)重程度受3個(gè)重要因素的影響：結(jié)扎盲腸的長(zhǎng)度、穿孔針的大小和CLP后的支持。結(jié)扎盲腸的長(zhǎng)度是死亡率的主要決定因素，隨著結(jié)扎盲腸的長(zhǎng)度的增加，促炎細(xì)胞因子的水平也在增加。來(lái)源：[1]李晗,田李均,韓旭東.膿毒癥體內(nèi)外模型研究進(jìn)展.中國(guó)與化療雜志,2020,20(01):.[2]彭鳳輝,鄧曉彬,呂立文.膿毒癥動(dòng)物模型的研究進(jìn)展.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2020,37。動(dòng)物造模 | 膿毒癥造模方法之CLP造模法。湖南動(dòng)物科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室

注意事項(xiàng)1.病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)主要包括：細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)(盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng))、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制(24、48小時(shí)的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷)、目的基因?qū)Σ《景b影響(基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會(huì)影響到是否能包裝成功)。，需要觀察包裝病毒后的48h培養(yǎng)基顏色是否橙紅。3.病毒濃縮：病毒一般在48h和72h各收一次。如果不想濃縮病毒的話(huà)，也可以直接將收集的病毒上清作為要的細(xì)胞的培養(yǎng)基，但是可能效果會(huì)不太好。并且一般收病毒時(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)損耗了很多，那樣直接培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)損害細(xì)胞，所以建議還是進(jìn)行濃縮后再。常見(jiàn)問(wèn)題1.包裝病毒時(shí)293T細(xì)胞狀態(tài)不好，或者鋪得過(guò)密，可以選擇放棄該次實(shí)驗(yàn)。2.目的載體過(guò)大，不易。3.避免轉(zhuǎn)染過(guò)程以及后續(xù)過(guò)程出現(xiàn)的污染。貴州兔科研技術(shù)服務(wù)外包實(shí)驗(yàn)干貨 | 分子克隆實(shí)驗(yàn)——無(wú)縫克隆。

應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明，否則切片難以鏡檢。（4）二甲苯應(yīng)盡量保持無(wú)水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無(wú)水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。5.透蠟注意事項(xiàng)（1）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋。透蠟時(shí)間根據(jù)組織大小而定。（2）盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度。（3）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低。（4）操作要迅速，力求在短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過(guò)程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。（5）注意溫度不要過(guò)高，以免組織發(fā)脆。6.染色水洗注意事項(xiàng)（1）染色原理：伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，如果細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比。（2）染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)。室溫高時(shí)促進(jìn)染色，染色時(shí)間可短些，否則可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。（3）注意流水不能過(guò)大，以防切片脫落。（4）如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色。

原理HE染色主要使用蘇木精和伊紅這兩種染液，其中蘇木精堿性染液為藍(lán)色，可以將組織的酸性結(jié)構(gòu)染成藍(lán)紫色（細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色；軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)；粘液呈灰藍(lán)）；伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中解離成帶負(fù)電荷的陰離子，易于蛋白質(zhì)氨基中的正電荷結(jié)合使細(xì)胞漿染色。細(xì)胞漿、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色。材料與儀器小鼠、固定液、酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟蘇木精染液、伊紅酒精溶液、鹽酸酒精溶液甘油蛋白粘片劑、中性樹(shù)膠石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、恒溫箱、蠟杯酒精燈、解剖剪、培養(yǎng)皿、鑷子、單面刀片染色缸、蓋玻片、載玻片、玻片盤(pán)、顯微鏡溫度計(jì)、水浴鍋步驟一、制作卵巢石蠟切片1、取材小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）進(jìn)行麻醉，頸椎脫臼法處死小鼠，取出雙側(cè)卵巢。取下所需組織，切成一小塊3~4mm厚。2、固定、洗滌、脫水（1）將切好的卵巢組織用生理鹽水洗一下，使用中性福爾馬林固定液固定30~50min。后用流水沖洗3次，每次5min。（2）卵巢組織依次經(jīng)70%、80%、90%乙醇溶液脫水，各30min。（3）再放入95%、100%乙醇溶液各2次，每次20min。3、透明、透蠟（1）使用純酒精、二甲苯等量混合液處理組織15min。科研中我們涉及到的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)通常指：免疫共沉淀（Co-IP）、RIP、Chip等等，將幾種實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單概述一下。

是整體甲基化進(jìn)程所必須的[2]。FTO是ALKB家族的成員，作為個(gè)被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控pre-mRNA的剪切加工過(guò)程[3]。目前已發(fā)現(xiàn)FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長(zhǎng)遲緩相關(guān)，揭示m6A可能對(duì)這些疾病具有重要的調(diào)節(jié)功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被發(fā)現(xiàn)具有去甲基作用的另一個(gè)成員，以RNaseA敏感的方式與核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7].此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7]，且ALKBH5敲除雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常，這可能是精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)改變的結(jié)果[7]。m6AmRNA修飾執(zhí)行其功能主要通過(guò)兩個(gè)途徑：精細(xì)調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，以阻止或誘使蛋白-RNA相互作用；或被直接由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，誘發(fā)續(xù)反應(yīng)。目前一類(lèi)含有YTH功能結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結(jié)合蛋白。其中YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2己被證實(shí)是ｍ６Ａ的結(jié)合蛋白.YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解，而YTHDC1結(jié)合ｍ６Ａ修飾的基因影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結(jié)合蛋白，參與pre-mRNA的加工[8]。細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心，它包含了遺傳物質(zhì)DNA，控制著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。上海外包科研技術(shù)服務(wù)培養(yǎng)

干貨分享 | 避坑，微生物培養(yǎng)的污染因素及預(yù)防方法，少走彎路。湖南動(dòng)物科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室

RNA各種可逆的化學(xué)修飾被認(rèn)為是一種新的表觀遺傳調(diào)控方式。m6A是真核生物mRNA常見(jiàn)的化學(xué)修飾，在調(diào)控mRNA穩(wěn)定性，剪切和翻譯方面具有重要的作用。作者使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了METTL3（甲基轉(zhuǎn)移酶3），一種主要的RNAN6-腺苷-甲基轉(zhuǎn)移酶，在人肝細(xì)胞（HCC）和多種實(shí)體中高表達(dá)。在臨床上，METTL3的過(guò)度表達(dá)與肝細(xì)胞患者不良預(yù)有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證明敲除METTL3會(huì)抑制HCC細(xì)胞增殖，遷移及克隆形成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明敲除METTL3會(huì)明顯抑制HCC體內(nèi)成瘤和肺轉(zhuǎn)移。另外，使用CRISPR/dCas9-VP64系統(tǒng)，內(nèi)源性高表達(dá)METTL3會(huì)促進(jìn)HCC細(xì)胞在體外和體內(nèi)生長(zhǎng)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、m6A-Seq、MeRIP-PCR，作者確定了SOCS2（細(xì)胞因子信號(hào)2的抑制因子）作為METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶基因。敲除METTL3表達(dá)會(huì)消除SOCS2mRNAm6A修飾并增強(qiáng)SOCS2mRNA表達(dá)。m6A介導(dǎo)的SOCS2mRNA降解是依賴(lài)于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2。總之，METTL3在HCC大部分高表達(dá)中,并通過(guò)m6A-YTHDF2依賴(lài)機(jī)制抑制SOCS2表達(dá)從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。因此，作者發(fā)現(xiàn)了在肝發(fā)生過(guò)程中表觀遺傳改變的一種新機(jī)制。圖4RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METLLT3在肝組織中高表達(dá)。湖南動(dòng)物科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室