單克隆抗體的生產(chǎn)已經(jīng)發(fā)展出高度成熟的平臺(tái)化純化工藝。其關(guān)鍵是蛋白質(zhì)A親和層析。蛋白質(zhì)A能高特異性、高親和力地結(jié)合大多數(shù)IgG的Fc區(qū)域，使得從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一步捕獲抗體達(dá)到極高的純度（>95%）。隨后，為了去除殘留的宿主細(xì)胞蛋白、DNA、聚合體、浸出的蛋白質(zhì)A以及可能的內(nèi)病毒，通常會(huì)跟進(jìn)一個(gè)或多個(gè)“精純”步驟。典型的平臺(tái)工藝是：Protein A親和層析 -> 低pH滅活/病毒滅活 -> 陰離子交換層析（流穿模式，去除酸性雜質(zhì)和DNA） -> 陽(yáng)離子交換層析（結(jié)合-洗脫模式，精細(xì)去除聚合體和堿性雜質(zhì)）。這個(gè)三步層析平臺(tái)被業(yè)界較廣采用，因其穩(wěn)健、高效且易于進(jìn)行工藝驗(yàn)證。蛋白分離純化技術(shù)有助于揭示生命活動(dòng)的生物學(xué)本質(zhì)。膜蛋白分離純化

混合模式層析的固定相配體設(shè)計(jì)為能夠同時(shí)通過(guò)兩種或多種不同的相互作用機(jī)制與蛋白質(zhì)結(jié)合，例如靜電相互作用與疏水相互作用的結(jié)合，或氫鍵與π-π相互作用的結(jié)合。這種多重作用機(jī)制使得其選擇性不同于傳統(tǒng)的IEX或HIC，往往能分離用傳統(tǒng)方法難以分開(kāi)的蛋白質(zhì)。它可以在高鹽條件下結(jié)合帶電荷的蛋白質(zhì)，這打破了傳統(tǒng)IEX的局限。羥基磷灰石層析是經(jīng)典的混合模式層析，其同時(shí)存在Ca2?位點(diǎn)（與蛋白質(zhì)的羧基作用，類似陽(yáng)離子交換）和PO?3?位點(diǎn)（與蛋白質(zhì)的氨基作用，并有氫鍵和金屬螯合作用）。混合模式層析為純化工藝開(kāi)發(fā)提供了新的有力工具。漢南區(qū)膜蛋白分離純化設(shè)備不同分子量的蛋白質(zhì)可通過(guò)濾膜分離技術(shù)進(jìn)行純化。

金屬螯合親和層析（IMAC）是重組蛋白純化中較常用的親和技術(shù)，利用His標(biāo)簽與二價(jià)金屬離子（Ni2?、Co2?、Cu2?）的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)分離。樹(shù)脂表面偶聯(lián)亞氨基二乙酸（IDA）或 nitrilotriacetic acid（NTA）基團(tuán)，可螯合金屬離子。His標(biāo)簽通常由6個(gè)組氨酸組成，其咪唑環(huán)可與金屬離子形成配位鍵。洗脫時(shí)通過(guò)咪唑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金屬離子，使目標(biāo)蛋白洗脫。NTA樹(shù)脂結(jié)合能力更強(qiáng)，特異性更高，可有效減少雜蛋白非特異性結(jié)合，適用于高純度蛋白制備。

冷凍電鏡技術(shù)，特別是單顆粒分析，對(duì)蛋白質(zhì)樣品的單分散性要求極高。樣品中必須盡可能避免聚集體、降解產(chǎn)物或構(gòu)象不均一的存在，否則會(huì)嚴(yán)重影響二維分類和三維重構(gòu)的分辨率。因此，用于冷凍電鏡的蛋白質(zhì)通常需要經(jīng)過(guò)極其精細(xì)的純化（如多次凝膠過(guò)濾）和嚴(yán)格的DLS、負(fù)染電鏡篩選。對(duì)于療愈用蛋白質(zhì)（尤其是哺乳細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的），下游純化工藝必須具備驗(yàn)證過(guò)的病毒清理/滅活能力，這是藥品監(jiān)管的強(qiáng)制要求。特定的純化步驟，如低pH孵育、去垢劑處理、納米過(guò)濾以及某些層析步驟（如陰離子交換），被證實(shí)能有效滅活或去除可能潛在的病毒污染物，確保產(chǎn)品的生物安全性。蛋白分離純化技術(shù)通常結(jié)合多種分離方法聯(lián)用。

一個(gè)高效的純化工藝不是一蹴而就的，而是通過(guò)系統(tǒng)性的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化過(guò)程建立的。它始于對(duì)目標(biāo)蛋白性質(zhì)和純化目標(biāo)的深入理解。接著是“篩選”階段：使用微量形式（如96孔板格式的層析樹(shù)脂）快速測(cè)試多種層析方法（IEX, HIC, IMAC等）在不同pH和鹽條件下的結(jié)合與洗脫行為，找到更有潛力的方法。然后進(jìn)入“優(yōu)化”階段：對(duì)篩選出的方法，在小型層析柱上詳細(xì)優(yōu)化其關(guān)鍵參數(shù)，如上樣量、洗滌條件、洗脫梯度等，以平衡分辨率、回收率和速度。然后，將優(yōu)化后的步驟按邏輯順序組合成一條“流程”，通常遵循“捕獲 -> 中間純化 -> 精純”的原則，并確保前后步驟的緩沖液兼容，以減少樣品處理步驟。超濾技術(shù)是一種常用的蛋白濃縮和分離手段。江夏區(qū)抗體蛋白分離純化基礎(chǔ)概念

通過(guò)蛋白分離純化技術(shù)可探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。膜蛋白分離純化

固定化金屬離子親和層析是重組蛋白純化中較廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。其原理是將螯合劑固定于介質(zhì)上，螯合鎳離子、鈷離子等過(guò)渡金屬離子，這些金屬離子又能與重組蛋白末端融合的寡聚組氨酸標(biāo)簽（如6xHis標(biāo)簽）特異性結(jié)合。結(jié)合后，通過(guò)提高咪唑濃度（咪唑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合金屬離子位點(diǎn)）或降低pH進(jìn)行洗脫。IMAC具有結(jié)合容量高、通用性強(qiáng)、條件溫和易于保持蛋白活性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為重組蛋白表達(dá)和純化標(biāo)準(zhǔn)化流程的關(guān)鍵。離子交換層析依據(jù)蛋白質(zhì)表面凈電荷的差異進(jìn)行分離。介質(zhì)表面帶有固定的離子基團(tuán)（如陰離子交換劑的季銨基，陽(yáng)離子交換劑的磺酸基），與帶相反電荷的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸附。通過(guò)逐步增加緩沖液離子強(qiáng)度，帶電較弱的蛋白質(zhì)先被洗脫，帶電強(qiáng)的后洗脫。該方法分辨率高、載量大、成本相對(duì)較低，常作為親和層析后的中間純化步驟，有效去除電荷性質(zhì)不同的宿主細(xì)胞蛋白、核酸及聚集體等雜質(zhì)。膜蛋白分離純化

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