等電點沉淀法利用蛋白質在等電點（pI）時凈電荷為零、溶解度比較低的特性實現分離。不同蛋白質的等電點存在差異，通過調節(jié)溶液pH值至目標蛋白的pI，可使目標蛋白沉淀析出，而雜蛋白仍溶解于溶液中。該方法操作簡便、成本低，但分辨率較低，常與鹽析法聯合使用以提高粗提效果。例如，在酪蛋白提取中，將牛奶pH值調節(jié)至4.6（酪蛋白的pI），酪蛋白會迅速沉淀，再經離心收集即可完成粗提。使用該方法時需緩慢調節(jié)pH值，避免局部pH驟變導致蛋白變性。親水性和疏水性分離技術可用于特殊蛋白的純化。北京酶蛋白分離純化基礎概念

緩沖液的選擇對蛋白純化至關重要，不同純化步驟需使用不同類型的緩沖液。粗提階段常用Tris-HCl緩沖液，因其緩沖范圍廣（pH 7.0-9.0）且對蛋白活性影響小；離子交換層析需根據樹脂類型選擇緩沖液，陽離子交換常用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.0-6.0），陰離子交換常用Tris-HCl緩沖液（pH 7.0-8.0）；親和層析則需使用與配體結合相匹配的緩沖液，如IMAC常用磷酸鹽緩沖液。緩沖液濃度通常為20-50mmol/L，過高濃度會影響蛋白與介質的相互作用。重組蛋白分離純化設備離心分離法是蛋白分離純化中有效的初步分離手段。

外泌體等細胞外囊泡的純化是當前研究熱點。由于其尺寸小、密度低，常用方法包括差速超速離心、密度梯度離心、尺寸排阻色譜以及基于特定膜蛋白的免疫親和捕獲。這些方法旨在從復雜的生物體液中分離出高純度的囊泡，同時保持其膜結構的完整性和生物活性，用于后續(xù)的功能與標志物研究。除了經典的組氨酸標簽，還存在多種其他親和標簽，如GST標簽、MBP標簽、FLAG標簽等。GST標簽可與固定化谷胱甘肽親和純化，且可能提高可溶性；MBP標簽是強大的增溶標簽；FLAG標簽則因其高特異性抗體可用于極溫和的洗脫。選擇標簽需綜合考慮對可溶性、活性、純化效率及后續(xù)應用的影響。

無論是在學術研究還是工業(yè)生產中，成本都是一個重要因素。純化過程的成本包括：層析樹脂（介質）的購買和壽命（可重復使用次數）、緩沖液和化學試劑的消耗、設備折舊與維護、以及人力成本和時間。工藝開發(fā)的目標之一就是在保證產品質量的前提下，優(yōu)化成本效益。這可能意味著：選擇載量高、壽命長的樹脂；減少純化步驟；開發(fā)重復使用多次的親和柱清洗驗證方案；將耗時的手工操作自動化；以及優(yōu)化緩沖液使用量以減少廢液處理成本。一個經濟上不可行的純化工藝是無法實現產業(yè)化的。操作人員需要豐富的經驗以確保蛋白分離純化的成功。

膜過濾根據孔徑大小和分離機制的不同，在純化流程的不同階段發(fā)揮著多種作用。微濾（0.1-10 μm）用于澄清，去除細胞碎片和大的顆粒物。超濾（UF）是依據分子量截留（MWCO， 通常1-1000 kDa）進行分離，其主要用途是：1）濃縮蛋白質溶液；2）透析/脫鹽，即更換緩沖液，去除小分子溶質（如鹽、抑制劑）；3）分級分離，分離不同大小的蛋白質。超濾/滲濾是層析前后非常重要的樣品處理步驟。納濾則用于去除更小的雜質，如病毒。切向流過濾（TFF）是處理大體積樣品時的高效過濾模式。采用分子生物學手段可輔助蛋白的分離純化過程。重組蛋白分離純化設備

不同蛋白質的分離純化方法因其物理性質而異。北京酶蛋白分離純化基礎概念

固定化金屬離子親和層析是重組蛋白純化中較廣泛應用的技術之一。其原理是將螯合劑固定于介質上，螯合鎳離子、鈷離子等過渡金屬離子，這些金屬離子又能與重組蛋白末端融合的寡聚組氨酸標簽（如6xHis標簽）特異性結合。結合后，通過提高咪唑濃度（咪唑競爭性結合金屬離子位點）或降低pH進行洗脫。IMAC具有結合容量高、通用性強、條件溫和易于保持蛋白活性等優(yōu)點，使其成為重組蛋白表達和純化標準化流程的關鍵。離子交換層析依據蛋白質表面凈電荷的差異進行分離。介質表面帶有固定的離子基團（如陰離子交換劑的季銨基，陽離子交換劑的磺酸基），與帶相反電荷的蛋白質分子發(fā)生靜電吸附。通過逐步增加緩沖液離子強度，帶電較弱的蛋白質先被洗脫，帶電強的后洗脫。該方法分辨率高、載量大、成本相對較低，常作為親和層析后的中間純化步驟，有效去除電荷性質不同的宿主細胞蛋白、核酸及聚集體等雜質。北京酶蛋白分離純化基礎概念

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