膜蛋白嵌于脂質雙分子層中，具有疏水表面，使其在水溶液中極易聚集和沉淀，純化難度遠大于可溶性蛋白。關鍵技術在于使用溫和的去垢劑（如DDM、Triton X-100）將其從膜中“溶解”出來，并在整個純化過程中維持去垢劑膠束的存在，以模擬其天然脂環境，保持其結構和功能。親和標簽策略在此同樣適用，但緩沖液配方的優化更為復雜和關鍵。療愈性單克隆抗體的生產已形成高度標準化的下游純化平臺。其關鍵是Protein A親和層析，它能從細胞培養上清中高特異性、高效率地捕獲抗體，實現較好的純化效果。隨后通常緊跟低pH孵育以滅活病毒，再經過離子交換層析（流穿模式）和疏水相互作用層析進一步去除宿主細胞蛋白、DNA、聚集體和殘留的Protein A。整個流程穩健、高效，確保了藥品的安全性與有效性。蛋白分離純化需要避免樣品的降解和非特異性吸附。河南凝膠過濾層析

FPLC和HPLC都是采用泵系統來精確控制流動相輸送的層析技術，區別于依靠重力流動的傳統柱層析。FPLC系統專為生物大分子（如蛋白質、核酸）設計，使用生物相容性的材料（如PEEK）流路，以中低壓（通常<5 MPa）運行，采用溫和的瓊脂糖或聚合物基質樹脂，旨在保持蛋白質的活性。它非常適合用于IEX， SEC， HIC和親和層析的精確分析和制備。HPLC則通常在更高的壓力下運行（10-40 MPa），使用剛性更強的硅膠基質小顆粒填料，提供極高的分辨率。反相層析（RPC）和離子交換層析（IEX）的HPLC形式常用于分析和小量制備，但HPLC的激烈條件可能使某些蛋白質變性。選擇FPLC還是HPLC取決于對分辨率、速度和蛋白質活性保持的綜合需求。硚口區蛋白分離純化蛋白分離純化對于研究抗體藥物有著重要意義。

對于從包涵體中回收的蛋白質，復性（重折疊）是關鍵的限速步驟。目標是讓變性的、隨機的多肽鏈重新折疊成具有特定三維結構和生物學活性的天然構象。基本策略是緩慢降低變性劑濃度，可以通過透析、稀釋或層析方法（如SEC在變性劑梯度下）實現。優化復性條件非常復雜，需要考慮：蛋白質濃度（過低效率低，過高易聚集）、pH、氧化還原對（用于正確形成二硫鍵，如GSH/GSSG）、溫度、添加劑（精氨酸、甘油等有助于抑制聚集）。通常需要高通量篩選來找到比較好復性條件。近年來，基于層析的在線復性技術（如在IEX或HIC柱上同時進行復性與純化）顯示出良好的應用前景。

雖然SPR本身不是一種純化技術，但它在純化工藝開發，特別是親和層析的開發和優化中扮演著關鍵角色。SPR能夠實時、無標記地測量生物分子間（如抗原-抗體、受體-配體）的相互作用動力學，即結合速率常數（ka）和解離速率常數（kd），并由此計算親和力（KD）。在開發免疫親和層析或其它基于生物特異性相互作用的純化方法時，SPR可以用于篩選高親和力的抗體或配體，并優化洗脫條件（如確定能有效解離復合物的pH或競爭劑濃度），從而指導高效親和純化策略的設計。通過反復純化步驟，可以提高蛋白質樣品的純度。

等電點沉淀是一種基于蛋白質在pH等于其等電點時凈電荷為零、溶解度比較低的原理進行的粗分離方法。通過調節樣品溶液的pH，可以使一類等電點相近的蛋白質或雜質沉淀出來，從而實現初步的富集或去除。該方法簡單、經濟，常作為大規模純化中的初始步驟。共價層析是一種特殊的親和層析，其固定相上的基團能與蛋白質表面的特定官能團形成可逆的共價鍵。例如，巰基丙基瓊脂糖凝膠可通過二硫鍵交換反應，特異性結合含有游離半胱氨酸殘基的蛋白質，隨后用含巰基還原劑（如L-半胱氨酸）的緩沖液進行洗脫。該方法可用于純化特定的酶或抗體片段。分離純化的蛋白為了解疾病機制提供了實驗基礎。河南凝膠過濾層析

蛋白分離純化的目的是獲得高質量的功能性蛋白。河南凝膠過濾層析

等電點沉淀法利用蛋白質在等電點（pI）時凈電荷為零、溶解度比較低的特性實現分離。不同蛋白質的等電點存在差異，通過調節溶液pH值至目標蛋白的pI，可使目標蛋白沉淀析出，而雜蛋白仍溶解于溶液中。該方法操作簡便、成本低，但分辨率較低，常與鹽析法聯合使用以提高粗提效果。例如，在酪蛋白提取中，將牛奶pH值調節至4.6（酪蛋白的pI），酪蛋白會迅速沉淀，再經離心收集即可完成粗提。使用該方法時需緩慢調節pH值，避免局部pH驟變導致蛋白變性。河南凝膠過濾層析

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